本文原文發(fā)表于Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 201 (2021), 114092. Author: Yuling Zhang, Pei Qi.如需原文，請(qǐng)與我們聯(lián)系。

摘要

 游離巰基是蛋白質(zhì)類(lèi)產(chǎn)品（包括單克隆抗體）的一個(gè)重要特性。本文使用一種新技術(shù)，即可變技術(shù)（），來(lái)量化單克隆抗體（mAbs）中游離巰基的數(shù)量，并且用到著名的Ellman試劑。簡(jiǎn)言之，蛋白質(zhì)（包括單抗）的未結(jié)合硫醇（游離巰基）與Ellman試劑反應(yīng)，產(chǎn)生2-硝基-5-硫苯甲酸鹽（TNB2?），它可以在412 nm的可見(jiàn)波長(zhǎng)下檢測(cè)到并能進(jìn)行量化。該方法不需要對(duì)稀進(jìn)行釋?zhuān)僮骱?jiǎn)單，可重復(fù)，花費(fèi)時(shí)間不到一個(gè)小時(shí)。將新方法得到的值與傳統(tǒng)紫外或熒光方法的文獻(xiàn)值進(jìn)行了比較。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)使用該驗(yàn)證方法兩年，所有支持?jǐn)?shù)據(jù)表明，該方法分析變異性小，且中間精度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）≤10%，定量限制（LOQ）為0.1 mol/mol，這足以使它成為一個(gè)很好的方法來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)（單抗）中的游離巰基的含量。

簡(jiǎn)介

游離硫基含量是單抗等蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)的一個(gè)重要特性，重要性在于巰基產(chǎn)生的二硫鍵可使蛋白質(zhì)適當(dāng)折疊，以形成蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。在單克隆抗體的生產(chǎn)過(guò)程中，偶爾會(huì)觀察到LC或LC上的自由輕鏈（LC）、自由重鏈（HC），如HL、HH、HHL或自由巰基，這些會(huì)影響產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。因此，快速響應(yīng)并精確測(cè)量自由巰基的含量，對(duì)巰基早期工藝開(kāi)發(fā)和后期生產(chǎn)監(jiān)控都至關(guān)重要。另外也很重要是，目前有報(bào)道指出，銅等金屬可以影響游離巰基的含量以及二硫鍵的穩(wěn)定性。

自從Ellman報(bào)道了5,5’-二硫-二（2-硝基苯甲酸）（DNTB，后被命名為Ellman試劑，用來(lái)檢測(cè)游離巰基）試劑以來(lái)，有許多文章在pH、變性條件和螯合劑方面改進(jìn)了埃爾曼試劑的反應(yīng)參數(shù)。還有其他標(biāo)記試劑，如4,4-二噻代二吡啶（4-DPS）和熒光標(biāo)記劑，如5-碘乙酰胺熒光素（5-IAF）或N-（1-吡啶）馬來(lái)酰亞胺（NPM）。HPLC和UPLC已經(jīng)被用作分離工具來(lái)支持對(duì)紫外線(xiàn)或熒光探測(cè)器的定量。最近，質(zhì)譜法被用來(lái)表征含有游離巰基的位點(diǎn)。傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)方法或熒光檢測(cè)方法和HPLC/UPLC方法不僅需要與游離巰基進(jìn)行反應(yīng)，而且還需要使用半胱氨酸或谷胱甘肽去校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。利用高效液相色譜/（HPLC/UPLC）技術(shù)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，通常需要稀釋試驗(yàn)樣品。這種情況下，測(cè)試一個(gè)樣品，除了需要一個(gè)控制和空白之外，通常還需要五點(diǎn)校準(zhǔn)，這是非常耗時(shí)的，由于這些巰基反應(yīng)物的穩(wěn)定性有限，它代表了潛在的變化來(lái)源。此外，HPLC或UPLC方法除了對(duì)柱子的調(diào)節(jié)外，還要為每次進(jìn)樣增加約15 min的分離時(shí)間。因此，這種方法的分析時(shí)間很長(zhǎng)，需要幾個(gè)小時(shí)才能完成。同樣值得注意的是，熒光檢測(cè)方法所需的一系列測(cè)試樣品的稀釋?zhuān)梢栽黾痈嗟淖儺愋浴?/span>

最近，一種使用SoloVPE儀器（可變光程技術(shù)）的紫外技術(shù)可用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量，并被證明有效地測(cè)量蛋白質(zhì)從0.01 Au到450 Au（或0.01 mg/mL到300 mg/mL）的吸光度，不要求任何稀釋。在本文中，據(jù)知是首次使用SoloVPE從已知濃度的DNTB定制緩沖液來(lái)確定消光系數(shù)（?），然后應(yīng)用該消光系數(shù)?來(lái)確定未知樣品中的游離巰基的含量，不需測(cè)量校準(zhǔn)曲線(xiàn)，也沒(méi)有樣品稀釋的要求。這種簡(jiǎn)化的過(guò)程提高了日常實(shí)驗(yàn)和制備冷凍緩沖試劑的準(zhǔn)確性和精度，測(cè)量5個(gè)樣品僅需要約一個(gè)小時(shí)。這些優(yōu)點(diǎn)可以被用來(lái)蛋白質(zhì)濃度或吐溫80儲(chǔ)存液濃度的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

SoloVPE法測(cè)定游離巰基的原理

眾所周知，傳統(tǒng)的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)使用1 cm比色杯作為固定光路長(zhǎng)度，檢測(cè)器在約2 Au（吸光度/cm，Abs/cm）處達(dá)到飽和。與傳統(tǒng)的紫外-可見(jiàn)光譜法不同，SoloVPE采用了一種基于光譜法的先進(jìn)技術(shù)，來(lái)快速收集可變光程長(zhǎng)度下的線(xiàn)性吸光度數(shù)據(jù)，由此確定以Abs/mm為單位的斜率值和回歸系數(shù)（R2）。不需要手動(dòng)稀釋?zhuān)膊恍枰?zhǔn)。SoloVPE從低至0.005 mm的路徑長(zhǎng)度讀取讀數(shù)，并可以測(cè)量高濃度蛋白質(zhì)樣品，而無(wú)需進(jìn)一步稀釋或空白背景校正。事實(shí)上，測(cè)試樣品濃度可以高達(dá)200倍于使用1厘米比色皿的傳統(tǒng)測(cè)量方法，而且吸光度可以高達(dá)450 Au（Abs/cm）。

這里我們把SoloVPE用于游離巰基的測(cè)量。當(dāng)半胱氨酸、BSA或單抗與DNTB反應(yīng)時(shí)，會(huì)生成2-硝基-5-硫代苯甲酸酯（TNB2?），該物質(zhì)在412 nm處產(chǎn)生吸收。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)反應(yīng)示意圖如Fig. 1所示。反應(yīng)混合物的紫外-可見(jiàn)光譜包括DNTB、TNB2?, 半胱氨酸或蛋白質(zhì)是由SoloVPE在Fig. 2所示的不同光程下通過(guò)快速測(cè)量模式收集的。光譜顯示，從190?600 nm有兩個(gè)特征峰，分別是280 nm - 330 nm之間，和400-430 nm之間。280 nm處的峰是由含有色氨酸或酪氨酸的氨基酸或DNTB或TNB2-的芳香苯環(huán)形成的。330 nm處的頂點(diǎn)和412 nm處的肩部的吸光度來(lái)自反應(yīng)物TNB2?。因此，這兩種波長(zhǎng)在文獻(xiàn)中都被用于檢測(cè)。然而，由于330 nm太接近280 nm的色氨酸吸光度，因此優(yōu)選412 nm。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較高時(shí)，會(huì)干擾游離巰基含量較低的讀數(shù)。因此，在本研究中，采用412 nm的波長(zhǎng)。

由于DNTB的性質(zhì)，在412 nm處觀察到背景吸光度。因此，所有測(cè)量都使用了基線(xiàn)校正。對(duì)于SoloVPE儀器，以Abs/mm（斜率）為單位記錄為測(cè)量的原始數(shù)據(jù)，而不是傳統(tǒng)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中的Abs/cm。為了防止SoloVPE的斜率（Abs/mm）與常規(guī)紫外-可見(jiàn)儀器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率混淆，將SoloVPE的斜率（Abs/mm）乘以10，即1 cm等于10 mm，換算成Au（Abs/cm），用下式表示。

這里使用Ellman試劑（DTNB）與游離巰基反應(yīng)，所得化合物在412 nm處有吸收，預(yù)先確定的消光系數(shù)為13700（變性條件）（M?1?cm?1）。應(yīng)用消光系數(shù)和朗伯-比爾定律測(cè)定了變性條件下含單抗蛋白的游離巰基含量。朗伯-比爾定律用以下方程式表示，以獲得游離巰基濃度：

自由巰基與單抗的摩爾摩爾比計(jì)算如下公式：

結(jié)論

本文報(bào)道了一種新的游離巰基測(cè)定方法，該方法可適用于單抗等蛋白類(lèi)物質(zhì)。Ellman試劑，在室溫下存放4小時(shí)，以及在2-8?C下存放18小時(shí)，都是穩(wěn)定的。該方法穩(wěn)健、準(zhǔn)確、高效。在pH=8時(shí)，測(cè)得的游離巰基的消光系數(shù)為13700(M?1?cm?1)，然后該消光系數(shù)用于測(cè)試未知樣品濃度，包括原液樣品和過(guò)程樣品，不需要測(cè)定校準(zhǔn)曲線(xiàn)。兩年的0.6 mol BSA的趨勢(shì)數(shù)據(jù)顯示，中間精度的RSD為5%。該方法用LOQ為0.1 mol：mol的單抗。